タカラバイオで販売されているIn-Fusion® HD Cloning Kitを利用した、遺伝子のplasmidへのクローニング方法です。経験上このkitが一番クローニング成功率が高く、6kbpの長いDNAもクローニングに成功しました。独自で改良しているので、本プロトコールで実験を実施する際は自己責任でお願いいたします。あくまでメモ書き程度の内容です。
■PCRプライマー設計はWEB参考 (http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006645)
目的遺伝子のPCRを実施して増幅産物を得る
■制限酵素処理
1. 5-10ug程度のplasmid + 制限酵素2ul + buffer
2. DWでUp to 50ul
3. 37℃ 1h
4. ゲル泳動へ、この時PCR産物も同時に泳動する
5. ゲルextraction 最終30ulでelution ※スタートプラスミドのの1/10ぐらいの収量になる。
■In fusion HDR reaction
1. 制限酵素処理後のゲル抽出liner plasmid 100ng
2. ゲル抽出PCR産物 モル比でx2倍量
3. In fusion 5x pre mix 2ul
4. DW up to 10ul
5. 15min at 50℃
6. Transformation（E colo sol 50ulで行う）
7. カナマイシン耐性plasmidの場合はSOC medをいれ回復操作をする。Ampの場合は500ulのSOC medを加えるのみとする
8. 上記を10 or 50ul or 400ulプレーティングする。
9. コロニーの回収
10. mini prep or コロニーPCRでインサート確認。
11. mini prep後はpcrでインサートの確認を行う。
当クローニングでは制限酵素サイトの塩基置換が起こるようで、制限酵素カットがうまくいかない事が多い。qPCRでインサートを早急に確認できる。qPCRでインサートを確認する場合はplasmid DNAを1-0.1ng/ulに合わせてテンプレートとする。インサートポジティブだとCT値１０前後となる。ネガティブだと増幅しないかノンスぺが増幅する。
12. サンガーシーケンスで目的インサートの配列が正しいか確認