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In-Fusion® HD Cloning Kit を用いた遺伝子クローニング

最終更新: 5月14日

タカラバイオで販売されているIn-Fusion® HD Cloning Kitを利用した、遺伝子のplasmidへのクローニング方法です。経験上このkitが一番クローニング成功率が高く、6kbpの長いDNAもクローニングに成功しました。独自で改良しているので、本プロトコールで実験を実施する際は自己責任でお願いいたします。あくまでメモ書き程度の内容です。


■PCRプライマー設計はWEB参考 (http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006645)

 目的遺伝子のPCRを実施して増幅産物を得る

■制限酵素処理

1. 5-10ug程度のplasmid + 制限酵素2ul + buffer

2. DWでUp to 50ul

3. 37℃ 1h

4. ゲル泳動へ、この時PCR産物も同時に泳動する

5. ゲルextraction 最終30ulでelution ※スタートプラスミドのの1/10ぐらいの収量になる。

■In fusion HDR reaction

1. 制限酵素処理後のゲル抽出liner plasmid 100ng

2. ゲル抽出PCR産物 モル比でx2倍量

3. In fusion 5x pre mix 2ul

4. DW up to 10ul

5. 15min at 50℃

6. Transformation(E colo sol 50ulで行う)

7. カナマイシン耐性plasmidの場合はSOC medをいれ回復操作をする。Ampの場合は500ulのSOC medを加えるのみとする

8. 上記を10 or 50ul or 400ulプレーティングする。

9. コロニーの回収

10. mini prep or コロニーPCRでインサート確認。

11. mini prep後はpcrでインサートの確認を行う。

当クローニングでは制限酵素サイトの塩基置換が起こるようで、制限酵素カットがうまくいかない事が多い。qPCRでインサートを早急に確認できる。qPCRでインサートを確認する場合はplasmid DNAを1-0.1ng/ulに合わせてテンプレートとする。インサートポジティブだとCT値10前後となる。ネガティブだと増幅しないかノンスぺが増幅する。

12. サンガーシーケンスで目的インサートの配列が正しいか確認


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